前言
RosettaVIP最早是为了解决人工设计蛋白不稳定的问题而开发的,RosettaVIP使用RosettaHoles的方法来发现蛋白质结构中折叠不合理的疏水空隙,并搜索合适的氨基酸来替代,使得蛋白核心折叠更加稳定。
算法原理:
RosettaVIP设计是通过不断迭代以下3个步骤实现:
- 使用RosettaHoles搜索蛋白内部中的疏水空隙,并确定该空隙周围的氨基酸组成;
- 将这些氨基酸单点突变为疏水氨基酸(Fixed Backbone Design);
- 将本轮具潜力的一些点突变进一步进行Relax优化的结构,计算单点突变的ddG值,并从这些点突变中选择最好的,在此突变的基础上进行下一轮迭代。
以上的迭代持续进行,直到找不到空隙,或没有更好点突变位点为止。
设计效果:
> 参考Automated selection of stabilizing mutations in designed and natural proteins一文
Benjamin 通过RosettaVIP算法对数据集测试: 结果显示算法相比于RosettaDesign算法可以更加准确地识别蛋白疏水内核的稳定型残基。并以人工重新设计的λ受体蛋白DNA结合结构域、Protein L进行内核优化,试验验证结果提示RosettaVIP均能解决重设计蛋白不稳定性的问题。
此外,他们团队也尝试将RosettaVIP应用于天然蛋白的设计,以eMAP为例,通过设计获得了含5个点突变的eMAP5,其Tm值提升17.6℃。并且经过回复突变验证,这5个点突变只有组合在一起时,才能起到强大的组合效应。
1 准备输入文件
准备RosettaVIP的运行参数文件flags, 内容如下:
- # 采样参数控制:
- -s Start_Lambda_Model.pdb # 定义输入的结构
- -ignore_unrecognized_res # 删除多余的无法识别的残基 以及 水分子
- -cp:ncycles 4 # 控制迭代次数(不推荐使用)。
- -cp:cutoff 6.0 # 定义可突变邻近氨基酸范围,文献值为7.0
- -cp:max_failures 1 # 代表一次命令运行中,如果出现了x次错误,才会退出程序,设置为5次,可以确保RosettaHoles找到空隙。
- -sasa_calculator_probe_radius 1.0 # 表面探针<p></p>
- <p style="line-height: 30px; text-indent: 2em;"># 控制侧链优化:
- -cp:pack_sfxn ref2015 # 设置打分函数
- -cp:exclude_file $filename # 允许定义不可突变的关键氨基酸 </p>
- <p style="line-height: 30px; text-indent: 2em;"># relax优化控制
- -cp:relax_sfxn ref2015 # 设置relax的打分函数
- -cp:skip_relax # 是否不进行额外的relax优化?
- -cp:relax_mover "relax" # 默认relax,可选"classic_relax",但是更慢
- #-cp:local_relax # 是否只进行局部relax的范围。针对大体系时启用,或对PDB结构进行截短处理,无关紧要的部分不考虑。demo中启用后,点突变寻找的能力下降,经常是失败的**。</p>
- <p style="line-height: 30px; text-indent: 2em;"># 报告输出
- -cp:print_reports # 将生成 reports.txt报告文件。
- -cp:print_intermediate_pdbs # 输出每一步的中间体蛋白PDB文件</p>
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exclude_file格式: 每行定义一个氨基酸(pdb number)。
- 如: 不允许A链128,136号计算突变:
写好之后,将文件的全名替换掉`-cp:exclude_file`后面的$filename即可。
2 运行RosettaVIP
demo以λ受体为例,测试RosettaVIP。
- # 切换到工作目录
- cd $ROSETTA/demos/public/vip/rosetta_inputs<p></p>
- <p style="line-height: 30px; text-indent: 2em;"># 直接运行
- vip.mpi.macosclangrelease @flags</p>
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3 结果分析
运行结果输出至`reports.txt`文件:
可见,RosettaVIP对于我们输入的PDB结构总共进行了多轮迭代: 其中每轮都列出了候选的突变类型以及ddEgoe值(一种简化的能量函数打分值,可粗略地判断突变对稳定性的影响)
第一轮Relax后,程序分析出了10、13、35、52、57、60、66、71位点突变对结构稳定性有提升。而L13I的稳定性提升更明显(ddEgoe:-4.6042),选取了该突变。
第二轮迭代筛选时是在L13I突变的基础上重新分析能够减少疏水空隙的点突变,新的结构基础上,突变的位置,以及能量贡献都发生了变化。
如此类推RosettaVIP模拟了"单点组合突变"的实验过程。
- Iteration 1 : Found candidate mutations:
- Position: 10 Native AA: ALA Mutant AA: LEU ddEgoe: -8.60701
- Position: 13 Native AA: LEU Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.75332
- Position: 17 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -5.2701
- Position: 31 Native AA: VAL Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.65599
- Position: 35 Native AA: ILE Mutant AA: LEU ddEgoe: -3.73465
- Position: 42 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -7.19784
- Position: 52 Native AA: PRO Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.66479
- Position: 57 Native AA: ALA Mutant AA: VAL ddEgoe: -5.48826
- Position: 60 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -6.92573
- Position: 61 Native AA: ALA Mutant AA: ILE ddEgoe: -5.89349
- Position: 64 Native AA: PHE Mutant AA: MET ddEgoe: -9.8102
- Position: 66 Native AA: VAL Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.52301
- Position: 68 Native AA: ILE Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.13047
- Position: 71 Native AA: PHE Mutant AA: TRP ddEgoe: -5.02144
- Iteration 1 : The following mutations were accomodated after relaxation:
- Position: 10 chain: 3 Native AA: ALA Mutant AA: LEU ddEgoe: -3.07001
- Position: 13 chain: 3 Native AA: LEU Mutant AA: ILE ddEgoe: -4.6042
- Position: 35 chain: 3 Native AA: ILE Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.76918
- Position: 52 chain: 3 Native AA: PRO Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.53427
- Position: 57 chain: 3 Native AA: ALA Mutant AA: VAL ddEgoe: -0.947129
- Position: 60 chain: 3 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -2.34727
- Position: 66 chain: 3 Native AA: VAL Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.05786
- Position: 71 chain: 3 Native AA: PHE Mutant AA: TRP ddEgoe: -3.56223
- Accepted mutation from LEU to ILE at position 13 chain: 3
- Iteration 2 : Found candidate mutations:
- Position: 8 Native AA: ALA Mutant AA: ILE ddEgoe: -2.1497
- Position: 10 Native AA: ALA Mutant AA: LEU ddEgoe: -8.0779
- Position: 17 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -5.2137
- Position: 31 Native AA: VAL Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.65536
- Position: 32 Native AA: ALA Mutant AA: MET ddEgoe: -4.9991
- Position: 35 Native AA: ILE Mutant AA: LEU ddEgoe: -3.64756
- Position: 42 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -7.00559
- Position: 52 Native AA: PRO Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.8697
- Position: 57 Native AA: ALA Mutant AA: ILE ddEgoe: -5.61317
- Position: 60 Native AA: PHE Mutant AA: ILE ddEgoe: -4.88678
- Position: 61 Native AA: ALA Mutant AA: ILE ddEgoe: -5.65812
- Position: 64 Native AA: PHE Mutant AA: MET ddEgoe: -6.68818
- Position: 66 Native AA: VAL Mutant AA: ILE ddEgoe: -1.49476
- Position: 68 Native AA: ILE Mutant AA: LEU ddEgoe: -1.04628
- Position: 71 Native AA: PHE Mutant AA: TRP ddEgoe: -4.97966
- .......................
- .......................
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对比最终效果的展示: 经过VIP design, 内部的疏水空隙明显减少。
**特别注意事项:**
- 不要额外调用`-ex1 -ex2`选项,会大幅度下降计算速度。程序内部设计时已经考虑了额外的Rotamer;
- RosettaVIP中relax是最耗时的部分,因此对大体系的计算能力不足,需要添加`-cp:local_relax`选项。
- RosettaHoles1寻找疏水空隙是随机算法,如果只允许一次,有可能找不到应有的空隙,因此需要多跑几次计算,可以尝试增加`-cp:max_failures`的参数值。多次计算结果,会输出多条不一样的序列。
- 点突变的假阳率大约在25%左右。
备注: RosettaVIP在线服务器: https://rosie.graylab.jhu.edu/vip (一键提交,但是需要等。氨基酸数目较多的蛋白不建议提交)